引物位置判断基于专家权威判断的引物位置确定
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pcr条带位置不对的原因？
pcr条带位置不对，说明pcr产物大小与预期不一致，要么变大了，要么变小了。其本质原因只有一个，pcr扩增是非特异性的扩增。
pcr非特异性扩增的原因有几个方面:
1.模板DNA或rna不对，包括模板污染，目标基因突变（部分缺失或有插入突变）；2.引物特异性不强或引物设计错误；3.pcr反应体系退火温度偏低，导致非特异性扩增。
pcr技术需要引物酶吗？
PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上游的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。
DNA的复制需要RNA引物，这是由DNA聚合酶和RNA聚合酶的特性决定的。DNA聚合酶不能从头合成DNA（需要引物DNA or RNA），因为DNA聚合酶具有高保真系统，这个系统要求，在新链的延伸过程中，只有新添加的碱基与模板链形成双螺旋才能继续链的延伸，否则延伸终止，启动切除修复机制，直至添加正确的碱基，也即是在DNA聚合酶的上游位置一定要互补形成双链（可以是RNA-DNA）才能继续下游DNA的合成，这是它的忠实性和高保真系统决定的
pcr技术引物和谁结合？
这要看你所设计的引物了，引物不同，它结合的位置也不同。在pcr中，94度的变性使dna双链成为单链，50度左右的复性使引物结合到模板链上，复性温度要根据引物的tm值。所以引物不是说只与首末端结合。
PCR过程基本为变性，退火，延伸；温度高时，DNA变性，双链解开；温度降低，引物与DNA结合（温度降低时，DNA链复性，单链变双链，引物过量，DNA与引物通过碱基互补配对原则识别结合），之后在taq酶作用下进行延伸。
pcr中的引物是什么？
引物是指化学本质为单链DNA、可与待扩增的DNA两侧碱基互补的寡核苷酸片段，其设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否，具体的设计原则包括：
1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2、引物GC含量一般为40%-60%， 45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近，一般Tm值不超过5℃。
3、引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间，最好为72℃左右。
4、引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰，且 3’端的碱基一般不用A；引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，或者引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5、碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。
6、尽量在基因的编码区（CDS序列）上设计引物，限制基因组DNA扩增。
7、使用BLAST检索，确认引物特异性。
PCR的引物怎样选取？
a引物长度一般在20bp左右，上下游引物碱基长度不要相差超过4个碱基。
b引物退火温度一般在58度，不同软件TM使用不同的算法，primer3，primer5，primer6，primerexpress等一般可以设置在55-58度，beacondesign可以设置在65左右。
cGC含量一般没什么特殊要求，40-60最好，如果不好设计，30-80也是可以的。
d产物长度在100-150,80-200也可以，不要在50bp左右，那样和引物二聚体不易区分，超过200bp可能会影响PCR扩增效率。
e软件给出的引物不能有发卡结构和超过3-4个碱基的匹配，特别是3`端不能有碱基匹配，那样更容易形成二聚体。
f引物设计好以后，在NCBI上做一个primer-blast，检测一下是否有非特异性扩增。